前
情
提
要
本期想分享抗性基因相关的研究，因此选择了浙江工业大学环境学院钱海丰团队2022年发表在Nature Communications的文章，希望详细了解抗性基因的分析方法。
本文的共同一作为张振炎、张琦博士研究生，和王庭璋研究员。钱海丰教授主要的研究方向是基于大数据分析和人工智能对微生物组的耐药性评估，污染物对水生微生物群落、及与植物-微生物互作影响等。
背景
重要概念/科学问题/研究内容
重要概念
ARGs（antibiotic resistance genes，抗生素抗性基因）：环境中筛选出的抵抗抗生素选择作用的基因。
MAGs（metagenome-assembled genomes，宏基因组组装的基因组）：常用的微生物组研究方法，通过对提取DNA的宏基因组测序，经生物信息学处理方法拼接并比对到参考基因组上，组装后的基因组称为MAGs。
*图源网络
MGEs（mobile genetic elements，移动遗传元件）：基因组中移动的DNA序列，如转座子，质粒等。
*图源网络
背景
抗生素抗性对人类健康和疾病治疗威胁日益严重。
人为活动，包括抗生素的临床使用，被广泛认为是ARGs传播的主要驱动因素。
有些ARGs起初是具环境功能的基因（e.g. 从磷酸盐中释放磷，或编码外流泵）。
科学问题
生物信息学鉴定为ARGs 的基因对人类健康构成怎样的健康风险？
本文提出4个因素对健康风险评估：
人体可及性(human accessibility, HA)：环境->人体接触细菌
移动性(mobility, MO)：非病原体->病原体
人类致病性(human pathogenicity, HP)：病原体->人类
临床可用性(clinical availability, CA)：ARGs的临床使用度
研究内容
1) 4,572个宏基因组揭示2,561个ARGs及其宿主在全球栖息地的分布和传播。
2) 4个指标的框架，定量评估每个ARGs和样本的健康风险。
3) 机器学习预测和绘制海洋栖息地中抗生素耐药性威胁。
研究方法
Methods
4,572个宏基因组经质控、修剪、注释、比对到参考基因组等处理，计算ARGs丰度；
获取人类种群密度数据，注释具有生物地球化学循环功能的基因，计算人类可及性(HA)；
18,465个MAGs中识别>10 kb，且与ARGs contigs有相同分类隶属关系的为ARGs宿主；
27,013个完整基因组注释，提取完整ARGs的上下游5 kb，注释MGEs(插入序列、转座酶、整合酶)，确定ARGs的流动性(MO)和人类致病性(HP)。
计算每个ARGs和样品的风险指数
根据RI值等分为四类（Q1-Q4），全球监测建模。
712个海洋宏基因组样本，随机森林算法的机器学习结合十重交叉验证，绘制全球海洋耐药性地图。
研究结果 part.1
ARGs分布的全球模式及传播
图1 抗生素耐药基因(ARGs)的全球分布模式。
a) ARG 样本在各栖息地的地理分布。点的大小反映样本数量，颜色表示栖息地。
b) 每个栖息地的ARG丰度。人类消化系统主要包括粪便样本。
c) 每个栖息地中抗生素抗药组的组成。仅显示至少包含20个样本的栖息地。
d) 高强度人类活动显著促进了ARG的丰度。样本分别为低强度组(n = 1643)和高强度组(n = 2309)。
e) 高强度或低强度人类活动区特定或共享的ARG数量。
f) 高强度和低强度人类活动环境中丰度显著增加的ARG。
g) 人类相关栖息地和三个主要栖息地之间共享的ARG数量。
采样点分布在6类栖息地（图1a），从综合抗生素研究数据库(CARD)鉴定共2,561种对24类抗生素具有耐药性的ARGs。其中160个基因对多种药物有耐药性。大多数ARGs的频率<10%（图s1a），近一半ARGs在不同的栖息地中共享（图s1b），尤其是氨基糖苷类(aminoglycosides)、四环素类(Tetracycline)和β-内酰胺类(beta-lactams)等广泛使用的抗生素（图s1c）。与人类相关的栖息地和建筑环境中的ARGs丰度高（图1b），主要是对四环素Tetracycline和氨基糖苷类药物Aminoglycoside以及多重药物Multidrug有耐药性（图1c）。
图s1 ARGs在样本和栖息地的分布。
a) 所有样本中ARGs的平均丰度和频率(n = 4,572)。顶部和右侧面板分别展示了频率和丰度的分布。
b) 不同栖息地的共享和特异的ARG。
c) 所有样本和特定栖息地中对特定药物有抗药性的ARG的频率。
为进一步探究人为活动对ARGs传播和丰度影响，计算每个样点的人类种群密度（>58人/km2被认为是人类活动高强度区）。结果发现高强度区ARGs总丰度显著更高（图1d），共检测到671个单独的ARGs（图1e），34个在低强度区有特异性，主要是β-内酰胺类耐药基因。受人为活动显著增加的共享的ARGs中，715个在高强度区中丰度更高（图1f），大多有β-内酰胺类和多重药物的耐药性。43个基因除耐药性外还有明确的生物功能（碳、氮、磷、硫循环相关）（图s5）。这表明不同ARGs与人为活动相关性不同，影响健康风险。
图s5 除抗生素耐药性外，ARG还具有生物功能
人类与其他三个栖息地共享的 ARGs，建筑环境最多（1,460）（图1g），大多对多种药物和β-内酰胺类有耐药性。人类可及性（HA）代表ARGs从环境转移到人体细菌群的能力。在人类栖息地中仅检测到1714种ARGs，大多数丰度<50 RPKM/sample（reads per kb per million)的频率<10%。四环素类抗生素耐药性的基因tetQ具有最高的HA（图s6），以上结果说明仅小部分ARGs构成健康风险。
图s6ARGs的人类可及性。
a) ARGs在人类相关栖息地的平均丰度和频率。
b) 根据丰度和频率计算人类可及性。tetQ，具有四环素抗生素耐药性，是人类相关栖息地中最常见的ARG。
研究结果 part.2
ARGs宿主及移动遗传元件(MGEs)的分布
通过严格的筛选，7,555个MAGs被鉴定为ARGs宿主，大多（89.61%）存在于特定的栖息地。建筑与人类相关栖息地的ARGs宿主多样性较少（图2b），可能是人为活动选择压力的结果。
MGEs可反映环境选择，其组成反映它们是否影响ARGs宿主的分布。结果显示，MGEs在丰度和丰富度上分别与ARGs呈显著正相关（图2c）。与ARGs宿主的分布类似，栖息地共享的MGEs也很少（3.8%）。
人为活动高强度区的MGEs丰度显著更高（图2d），可能导致将更多的ARGs插入基因组（图2e），推动非病原体和病原体间共享ARGs的增加（图2f），同时扩大了ARGs的潜在致病宿主的范围（图2g）。表明MGEs 可能对宿主间ARGs的水平基因转移有贡献，尤其从非病原体到病原体。
图2 ARG的人类致病性和流动性。
a) ARG宿主是仅考虑超过10 kb的contigs的ARG来确定，并确保含ARG的contigs与MAG的分类一致。
b) 抗生素耐药性宿主的门水平组成显示了ARG宿主在四个主要栖息地的分布。
c) MGEs在丰度和丰富性上与ARGs表现出显著的正相关。
d) 高强度人类活动区域(n = 2309)的MGE丰度明显高于低强度区(n = 1643)。
e) 与低强度人类活动区相比，高强度区包含多个ARG的基因组数量增加。
f) 与低强度区相比，病原体或非病原体中的共享ARG在高强度区增加。
g) ARG的致病性宿主在高强度人类活动区增加。
h) 从NCBI RefSeq数据库收集了27,013个完整的基因组，以确定ARG的人类致病性和移动性。在完整基因组中检测ARGs的上游和下游5 kb，用于注释MGE。
i) 27,013个完整基因组中，16,889个被认定为病原体基因组。
j) 从完整基因组中鉴定了4,612个MGE，大部分为转座酶。
k) ARGs的人类致病性表现出双模态分布，而大多数ARGs（2,266/2,561）显示出迁移率<10。
16,889个完整基因组被识别为病原体（图2i）。MGEs的数量定义为ARGs的（潜在）迁移率(MO)。注释共鉴定出4,612个MGEs，大多数是转座酶(3,061/4,612)（图2j），且大多数的ARGs (2,265/2,561)由不到10种MGEs携带(MO<10)（图2k）。根据ARGs病原体比例确定潜在人类致病性(HP)，呈现明显的双峰分布，表明大多数ARGs具有特定遗传背景，仅由非病原体(HP= 0)或仅由病原体携带(HP= 1)。
研究结果 part.3
ARGs和样本的健康风险评估
收集全球抗生素使用数据，发现青霉烷（55.25%）和头孢菌素类（13.07%）这两种β-内酰胺类抗生素使用最多。临床可用性(CA)用ARGs产生抗性的抗生素数量表示。风险指数(RI)用人类可及性(HA)、移动性(MO)、人类致病性(HP)以及临床可用性(CA)四个指标乘积计算（图3a-b）。2,561个ARGs中，只有23.78%被认为有健康风险，且有多重耐药性（图3c-d）。
图3 ARG的健康风险评估。
a) 用四个指标评估每个ARG的人类健康风险，包括人类可及性(HA)、移动性(MO)、人类致病性(HP)、临床可用性(CA)。
b) 风险指数中的每个指标排除零值后ARG的数量。
c) 所有评估的ARG中只有23.78%表现出风险指数(RI) > 0。由于使用了严格的公式，大多数ARG的RI为零。
d) 每个类别中ARG的数量和平均RI。仅显示RI > 0的ARG超过10个的类。
e) RI > 0的不同类别的ARG的组成。大多数抗常用抗生素的ARG属于Q1，而大多数抗很少使用抗生素的ARG属于Q4。
f) 每个致病基因组的ARG数量，由医院粪便元基因组（n = 568 MAGs）或从完整基因组数据集（n = 15,596 MAGs）组装。
g) 四个主要栖息地的全球ARG风险图。每个采样点的平均RI是通过ARG的丰度和RI组合计算的，显示为点的大小。
根据风险指数(RI)排名从高到低等分为四类，大多数抗常用抗生素，或多重药物的ARGs属于Q1，对糖肽等很少使用的抗生素具有耐药性的ARGs属于Q4（图3e）。证实了使用抗生素会增加 ARGs 对人类健康的风险，导致临床治疗失败。使用568个医院致病性MAGs和完整基因组中病原体数据，验证了属于Q1的ARGs数量显著高于其他等级，相反属于Q3和Q4的ARGs很少被病原体基因组携带（图3f）。
结合ARGs丰度和RI值对全球监测建模，评估每个样本的抗生素健康风险。结果表明抗生素耐药性的风险是全球性的，即使极地地区也存在风险，与人类相关栖息地的风险最高（图3g）。
研究结果 part.4
海洋抗生素耐药性威胁的全球地图
使用712个海洋宏基因组样本，通过机器学习的方法绘制全球抗生素耐药性威胁预测地图。通过三种无监督方法（k-means、等宽和等频）对数据集进行离散化（图4a），把样本分成10个风险等级（最高为10级），加上18个相关指标作为输入数据（图4d）。机器学习使用随机森林算法结合十重交叉验证进行。
最终选择模型最优的k-means，具有76.6%准确度，ROC曲线说明每个等级的准确率也比较好（图4b-c）。
图4 海洋栖息地抗生素耐药性威胁的全球映射。
a) 机器学习由来自海洋栖息地的712个样本进行训练，并用于预测全球海洋栖息地的抗生素耐药性威胁。
b) 不同离散化方法的机器学习的准确性。k-means的准确率高于等频，因此选择最佳模型（准确率 = 76.06%）进一步预测。
c) ROC图证实了最佳模型在风险等级分类方面的高性能（ROC曲线下的面积为AUC值）。
d) 纬度和气候变化压力因素在预测抗生素耐药性风险方面具有高度重要性。
e) 海洋栖息地的ARG风险地图，通过机器学习预测结果，由ArcGIS以20′×20′分辨率绘制。
机器学习绘制的抗生素耐药性地图与对每个国家和地区ARGs的丰度预测一致。如巴西和非洲的海洋区域的ARGs风险高于靠近美国东部，与Hendriksen等人研究中巴西和非洲城市污水中ARGs丰度较高的结果一致。地图呈现太平洋和大西洋的抗生素耐药威胁高于其他海洋，南极高于北极的模式（图4e）。
然而受样本数量限制，样本的海洋覆盖度较低（712/4,572），未来需要更多高质量宏基因组数据集，同时因样本不均及缺乏原始土壤特征，无法绘制陆地和人类相关栖息地的耐药性威胁地图。
总结&讨论
Summary & Discussion
抗性基因(ARGs)在生境中的传播，及ARGs从非病原体到病原体的水平基因转移，随人为活动强度增强而增加，与移动遗传元件(MGEs)丰度的增加有关；
不同环境的不同宿主类群中发现了特定的ARGs；
更严格的质控标准检查宏基因组拼装的基因组(MAG)，提高了ARGs宿主识别的准确性。亟需全球合作系统用于医疗，提供预警。
ARGs的健康评估体系建立，但有例外（β-内酰胺类是很常见的抗生素，却检测到很少存在风险的ARGs；属于最后一道防线的抗生素（如万古霉素）的ARGs却是最低等级的风险）
思考：
ARGs/MRGs (metal resistance genes)与其他生物学功能有什么深层联系？
未来可以结合实测数据，与预测的ARGs分布验证。
考虑气候变化对ARGs分布的影响（除了冰川融化，洋流变化）。
原文题目：Assessment of global health risk of antibiotic resistance genes
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29283-8
作者丨万千若
专业丨生态学
年级丨2025级博士
北京师范大学 BNU